62/2000 Proteggere la salute dei neonati e dei bambini piccoli!

Prefazione

Gli oligosaccaridi del latte umano (HMO) sono un gruppo di oligosaccaridi con un grado di polimerizzazione non superiore a 3, naturalmente presenti nel latte umano; sono il terzo componente solido più abbondante nel latte umano, dopo il lattosio e i grassi. Regolano la flora intestinale, promuovendo in particolare la colonizzazione dei Bifidobacteri nell'intestino del neonato, mantenendo al contempo la salute intestinale, supportando lo sviluppo immunitario e cerebrale ed esercitando effetti anti-infettivi, svolgendo un ruolo importante nella crescita del neonato. Dal lancio della prima formula per lattanti fortificata con HMO negli Stati Uniti nel 2015, una vasta gamma di formule per lattanti, prodotti lattiero-caseari, integratori per la salute digestiva e alimenti funzionali contenenti HMO sono stati venduti in tutto il mondo. Al 1° giugno 2023, gli Stati Uniti e l'UE hanno approvato sette HMO per l'uso: 2'-fucosil-lattosio, 3'-fucosil-lattosio, difucosil-lattosio, lattosio-N-neotetarosio, lattosio-N-tetarosio, 3'-sialil-lattosio e 6'-sialil-lattosio.

Tra i comuni metodi di rilevamento degli HMO, la cromatografia liquida richiede una reazione di derivatizzazione prima del rilevamento, comporta una complessa preparazione del campione e i reagenti di derivatizzazione sono spesso tossici; la natura termolabile degli HMO porta anche a una bassa risposta e a una scarsa ripetibilità in LC-MS. Al contrario, la cromatografia ionica con rivelazione amperometrica per carboidrati offre una preparazione del campione semplice, un'elevata risposta e una buona ripetibilità, conferendole chiari vantaggi per l'analisi degli HMO. Questa nota applicativa utilizza idrossido di sodio, acetato di sodio e acqua ultrapura preparati manualmente come eluente, e impiega il cromatografo ionico WAYEAL IC6300 per determinare gli HMO nelle formule per lattanti. Il metodo presenta una preparazione del campione semplice, un'elevata sensibilità e una buona linearità, fornendo un utile riferimento per il rilevamento degli HMO negli alimenti.

Parole chiave: cromatografo ionico; oligosaccaridi del latte umano; rivelatore amperometrico.

1. Strumenti, Apparecchiature e Reagenti

1.1 Reagenti e Standard

Tabella 1. Elenco dei reagenti e degli standard

1.2 Materiali di Laboratorio e Attrezzature Ausiliarie

• 1.2.1 Bilancia analitica (leggibilità 0,1 mg);
• 1.2.2 Bagno termostatico ad acqua;
• 1.2.3 Centrifuga;
• 1.2.4 Filtri a membrana in polietere-solfone (PES) acquosi (0,45 µm);
• 1.2.5 Acqua ultrapura;
• 1.2.6 Dispositivo di filtrazione sottovuoto;
• 1.2.7 Cartucce di pretrattamento per estrazione in fase solida (SPE) RP;
• 1.2.8 Siringhe monouso (20 mL, 5 mL).

2. Metodo Sperimentale

2.1 Preparazione delle Soluzioni

• 2.1.1 Soluzione di idrossido di sodio 200 mmol/L: Pipettare 10,5 mL di NaOH al 50%, diluire con acqua fino a 1000 mL e filtrare sottovuoto.
• 2.1.2 Soluzione mista di NaOH 75 mmol/L e acetato di sodio 250 mmol/L: Pesare accuratamente 20,51 g di acetato di sodio, sciogliere in acqua e trasferire in un matraccio tarato da 1000 mL; pipettare accuratamente 3,95 mL di NaOH al 50%, diluire fino a 1000 mL con acqua ultrapura e filtrare sottovuoto.
• 2.1.3 Soluzione di acido sulfosalicilico al 3%: Pesare 3,0 g di acido sulfosalicilico, sciogliere in acqua e diluire fino a 100 mL (preparare al momento).
• 2.1.4 Soluzione madre standard mista: Pesare accuratamente 5 mg ciascuno di 2'-fucosil-lattosio, 3'-fucosil-lattosio, 3'-sialil-lattosio, 6'-sialil-lattosio, lattosio-N-tetarosio e lattosio-N-neotetarosio (al centesimo di mg più vicino), porre in un matraccio tarato da 10 mL, sciogliere in acqua e diluire fino al segno per preparare una soluzione madre mista da 500 mg/L. Pesare separatamente 1 mg di difucosil-lattosio (al centesimo di mg più vicino), porre in un matraccio tarato da 10 mL, sciogliere e diluire fino al segno per preparare una soluzione madre da 100 mg/L.
• 2.1.5 Soluzioni di lavoro standard miste: Pipettare accuratamente la soluzione madre mista (2.1.4) in matracci tarati e diluire con acqua per preparare soluzioni di lavoro miste di 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT e DFL a 0,5, 2, 4, 6, 8 e 10 mg/L. Preparare al momento prima dell'uso.

2.2 Preparazione del Campione

Pesare circa 2,0 g di campione in un becher piccolo, mescolare accuratamente con 50 mL di acqua calda (circa 50 °C), aggiungere 40 mL di soluzione di acido sulfosalicilico al 3%, trasferire e diluire fino a 100 mL in un matraccio tarato, e sonicare per 10 minuti. Filtrare attraverso carta da filtro o centrifugare (12.000 giri/min, 15 minuti). Passare la soluzione del campione attraverso una cartuccia SPE RP e quindi attraverso un filtro a membrana acquoso da 0,45 µm; scartare i primi 3 mL e raccogliere l'eluato per l'analisi. Prima dell'uso, condizionare la cartuccia SPE RP con 20 mL di metanolo seguito da 15 mL di acqua, e equilibrare per 30 minuti.

2.3 Condizioni Sperimentali

2.3.1 Condizioni di cromatografia ionica

3. Risultati

3.1 Intervallo Lineare

È stata analizzata un'aliquota appropriata di ciascuna soluzione di lavoro standard mista. L'intervallo lineare era 0,5-10 mg/L; le deviazioni tra le concentrazioni misurate e nominali erano entro la deviazione massima consentita, i valori di R² erano superiori a 0,999 e tutti i componenti hanno mostrato una buona linearità.

Tabella 2. Intervalli lineari dei composti

Figura 1. Cromatogrammi di calibrazione sovrapposti dei sette standard HMO

3.2 Risultati dei Test sui Campioni

I campioni 1 e 2 sono stati testati dopo diluizione 10 volte. Il contenuto di ciascuno dei sette HMO è stato calcolato come segue: X è il contenuto nel campione (mg/100g); c è la concentrazione nella soluzione del campione dalla curva di calibrazione (mg/L); V è il volume costante (mL); m è la massa del campione (g); f è il fattore di diluizione. I contenuti calcolati (mg/100g) sono i seguenti:

Figura 2. Cromatogramma ionico del campione 1 diluito 10 volte

Figura 3. Cromatogramma ionico del campione 2 diluito 10 volte

Tabella 3. Risultati dei test sui campioni

3.3 Precisione

La soluzione di lavoro al quarto livello di calibrazione è stata analizzata in sei iniezioni consecutive nelle condizioni di cui al punto 2.3.1. È stata calcolata la RSD dei contenuti dei sette HMO per valutare la ripetibilità. I risultati sottostanti indicano una buona precisione del metodo.

3.3.1 Precisione di Ripetibilità dello Standard

Risultati del test:

Figura 4. Cromatogrammi sovrapposti di iniezioni replicate indipendenti dello standard di calibrazione S4

Tabella 4. Precisione di ripetibilità dello standard

3.4 Limiti di Rilevamento e Quantificazione

LOD: Aliquote della soluzione standard sono state diluite in una soluzione mista contenente 10 µg/L di 3'-FL, 30 µg/L di DFL, 30 µg/L di 2'-FL, 22 µg/L di LNnT, 67 µg/L di LNT, 67 µg/L di 6'-SL e 160 µg/L di 3'-SL; sono stati preparati e analizzati 20 campioni paralleli.

LOQ: Aliquote della soluzione standard sono state diluite in una soluzione mista contenente 30 µg/L di 3'-FL, 80 µg/L di DFL, 90 µg/L di 2'-FL, 65 µg/L di LNnT, 200 µg/L di LNT, 200 µg/L di 6'-SL e 500 µg/L di 3'-SL; sono stati preparati e analizzati sei campioni paralleli.

I risultati del test sono i seguenti:

Tabella 5. Risultati S/N per LOD e LOQ dei sette HMO

3.5 Specificità

Aliquote (100 µL ciascuna) di soluzioni standard di glucosio, fruttosio, saccarosio e maltosio sono state aggiunte a un matraccio tarato da 10 mL e diluite fino al segno con la soluzione del campione 2 diluita 67 volte. La soluzione è stata analizzata per verificare se questi zuccheri interferissero con i picchi dei sette HMO. Come mostrato di seguito, i quattro zuccheri non hanno mostrato interferenze significative con la determinazione dei sette HMO nel latte in polvere.

Figura 5. Cromatogrammi sovrapposti di calibrazione S6, Campione 2 e Campione 2 fortificato con i quattro standard di zuccheri

4. Conclusione

Questa validazione ha utilizzato il cromatografo ionico WAYEAL per verificare il metodo di determinazione degli HMO negli alimenti. I dati mostrano che tutti i picchi cromatografici sono ben formati senza code; 2'-FL, 3'-FL, DFL, LNnT, LNT, 6'-SL e 3'-SL eluiscono tutti entro 60 minuti; la sensibilità soddisfa i requisiti degli standard nazionali; e i coefficienti di correlazione lineare sono tutti superiori a 0,999. La ripetibilità sia degli standard che dei campioni è buona. Ad eccezione dei due sialil-lattosi, il LOD e il LOQ sono a livello di µg/L. Il metodo ha una buona specificità, senza impurità interferenti riscontrate, e nel complesso soddisfa i requisiti dello standard.