Determinazione dell'aflatossina B₁, una sostanza cancerogena del gruppo 1, nelle colture oleaginose mediante il sistema LC-MS/MS Wayeal LCMS-TQ9200

Aflatoxina B₁è un metabolita secondario altamente tossico prodotto principalmente da Aspergillus flavusTra le aflatoxine, è la più tossica e la più diffusa.Esercita i suoi effetti tossici inibendo la sintesi intracellulare di DNA e RNA e interferendo con il metabolismo delle proteine, con un effetto dannoso altamente mirato sul fegato.Rispetto ad altre micotossine come l'ocratossina e la patulina, l'aflatossina B₁è estremamente tossico e ha una carcinogenicità ben comprovata. Carcinogeni del gruppo 1è spesso rilevato nelle colture oleose come arachidi, mais, noci e oli vegetali,rendendolo un contaminante prioritario per il controllo della sicurezza alimentare in tutto il mondo.

Contaminazione da aflatossina B₁si verifica in genere quando le colture oleose sono esposte a condizioni di alta temperatura e umidità durante la semina, la raccolta o la conservazione, che favoriscono la crescita dei funghi.a causa delle sue proprietà chimiche stabili, aflatossina B₁non possono essere distrutti dalle temperature di cottura convenzionali, con conseguente problema ricorrente di residui nei prodotti agricoli e negli alimenti trasformati.

L' ingestione a breve termine di una dose elevata può causare un avvelenamento acuto, con sintomi come forti dolori addominali, vomito, ittero e insufficienza epatica, che possono essere fatali nei casi più gravi.L' esposizione a lungo termine a basse dosi porta all' accumulo nel fegato, inducendo lesioni epatiche croniche come la fibrosi epatica e la cirrosi, e possono persino provocare il cancro primario al fegato.e persone con malattie epatiche preesistenti, hanno un rischio maggiore di aflatoxina B₁avvelenamento.

In Cina, la norma nazionale GB 2761-2017 (norma nazionale per la sicurezza alimentare ¢ livelli massimi di micotossine negli alimenti) specifica i limiti massimi di residui di aflatossina B.₁in vari tipi di alimenti. GB 5009.22-2016 (Standardo nazionale per la sicurezza alimentare - Determinazione delle aflatossine B e G negli alimenti)fornisce metodi analitici ufficiali per la determinazione dell'aflatoxina B₁.

La presente nota di applicazione descrive la definizione di un metodo di cromatografia liquida a diluzione isotopica e spettrometria di massa a tandem (LC-MS/MS) per la determinazione dell'aflatoxina B.₁utilizzando il sistema Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS.

Parole chiave:Tripli quadrupoli; aflatossina B.₁; cromatografia liquida di diluizione isotopica-spettro di massa in tandem.

1Strumento e reagenti

1.1 Configurazione dello strumento

Tabella 1 Elenco delle configurazioni degli strumenti

1.2 Reagenti e standard

Tabella 2 Reagenti e standard

1.3 Materiale sperimentale e attrezzature ausiliarie

Miscelatore a vortice

Centrifughe ad alta velocità

Bilancio analitico

Centrifughe

Manifold di estrazione in fase solida (SPE) (con pompa a vuoto)

Evaporatore di azoto

Scalatore

2Metodo sperimentale

2.1 Preparazione della soluzione

2.1.1 5 mmol/L Soluzione di acetato di ammonio:Pesare 0,39 g di acetato di ammonio, dissolverlo in acqua e diluirlo fino a 1000 ml. Mescolare bene.

2.1.1 Soluzione di metanolo-acetonitrile:Aggiungere 100 ml di acetonitrile a 100 ml di metanolo e mescolare bene.

2.2 Pretrattamento del campione

2.2.1 Estrazione di campioni

Passare la farina di frumento attraverso un setaccio di prova con apertura di 2 mm. Pesare 5 g del campione (con precisione di 0,01 g) in un tubo centrifugo da 50 ml. Aggiungere 100μL di soluzione di lavoro standard interna di isotopi (100ng/mL), mescolata per vortice e lasciata fermarsi per 30 minuti. Aggiungere 20 ml di soluzione di metanolo-acqua (70+30, v/v), vortice per mescolare,e agitare su un agitatore orbitale per 20 minuti. Centrifugare a 6000 r/min per 10 min. Raccogliere il supernatante per un uso successivo.

2.2.2 Purificazione dei campioni

Trasferire con precisione 4 ml di supernatante in un contenitore, aggiungere 23 ml di 1% di Tritone X-100 in PBS e mescolare bene.

Dopo che il liquido originale nella colonna di immunoaffinità è stato completamente drenato, trasferire la soluzione del campione sopra riportata in una botte di siringa da 50 ml.Regolare il flusso in modo che la soluzione del campione passi costantemente attraverso la colonna a una velocità di 1 ‰ 3 ml/min. Dopo che la soluzione del campione è stata completamente drenata, aggiungere 2 × 10 ml di acqua nel barile della siringa e lavare la colonna di immunoaffinità a un flusso costante.asciugare la colonna con una pompa a vuoto.

Disconnettere il sistema a vuoto, posizionare una provetta graduata da 10 ml sotto la colonna di immuno-afinità, rimuovere il barile della siringa da 50 ml,e aggiungere 2 × 1 ml di metanolo per eludere la colonna ad un flusso controllato di 1 ‰ 3 ml/min. quindi asciugare nuovamente la colonna con una pompa a vuoto. raccogliere tutto l'eluato nella provetta.Evaporare delicatamente l'eluato fino a quasi asciugatura sotto un flusso di azoto a 50 °C. Aggiungere 1 ml della fase mobile iniziale, vorticare per 30 secondi per sciogliere il residuo.filtro a membrana da 22 μm, e raccogliere il filtrato in un flaconcino per campionamento automatico per la successiva iniezione.

2.3 Condizioni sperimentali

2.3.1 Metodo di cromatografia liquida

Colonna: C18, 1.7μM, 2.1×50 mm

Fase mobile: A: soluzione di metanolo-acetonitrile; Fase B: soluzione di acetato di ammonio 5 mmol/L

Velocità di flusso: 0,3 ml/min

Temperatura della colonna: 40- Sì.C

Volume di iniezione: 3μL

2.3.2 Metodo di spettrometria di massa

Tabella 3 Parametri di spettrometria di massa composta

Nota: l'asterisco (*) indica l'ione quantitativo.

3Risultato dell' esperimento

3.1 Cromatogramma standard

Determinazione dell'aflatoxina B₁e l'isotopo standard interno 13C17-aflatoxina B₁Come illustrato nella figura 1, entrambi gli analiti hanno mostrato ottime forme di picco e risposte soddisfacenti, soddisfacendo i requisiti per l'analisi sperimentale.

Fig. 1 Cromatogrammi di aflatossina B₁e lo standard interno per gli isotopi 13C17- Sì.-Aflatoxina B₁

3.2 Distanza lineare

An appropriate volume of the standard stock solution and mixed isotope internal standard working solution were accurately transferred and diluted with the initial mobile phase to prepare a series of standard working solutions with aflatoxin B₁Ogni soluzione conteneva lo standard interno dell'isotopo a una concentrazione di 2ng/mL. Una curva di taratura è stata costruita utilizzando questi standard.Oltre il range lineare di 0.5️50 ng/mL e dopo correzione con 13C 17-aflatoxina B₁come standard interno, le deviazioni tra l'aflatoxina B misurata e quella nominale₁Le concentrazioni erano entro la deviazione massima ammissibile.999, che indica un'eccellente linearità.

Fig. 2 Curva standard dell'aflatoxina B₁

3.3 Ripetibilità

Le soluzioni standard a tre concentrazioni (1, 10 e 20 ng/ ml) sono state iniettate sei volte consecutive.Le deviazioni standard relative (RSD) dei tempi di ritenzione e delle quantità di campione per l'aflatoxina B₁a basse, medie e alte concentrazioni erano tutte entro il 5%, soddisfacendo i requisiti dell'esperimento.

Tabella 4 Prova di ripetibilità dell'aflatoxina B₁a basse, medie e alte concentrazioni

3.4 Recupero di picchi

Aflatoxina B₁Il risultato medio di sei iniezioni consecutive è stato di 5.147 ng/mLIl tasso di recupero calcolato è stato del 102,94%, che soddisfa i requisiti dell'esperimento.

3.5 Residui in bianco

Dopo aver iniettato continuamente la soluzione standard di 20 ng/ ml, è stato successivamente iniettato un campione in bianco per valutare il riporto.

Fig. 3 Cromatogramma in bianco del composto

3.6 Prova del campione

Aflatoxina B₁non è stato rilevato nel campione A (figura 4).

Fig. 4 Cromatogramma dell' aflatossina B₁nel campione A

4Conclusioni

In questo studio è stato utilizzato un metodo di cromatografia liquida con diluizione isotopica e spettrometria di massa a tandem (LC-MS/MS) per la determinazione dell'aflatoxina B.₁è stato stabilito utilizzando il sistema Wayeal LCMS-TQ9200 di cromatografia liquida e spettrometria di massa in tandem.I dati ottenuti dimostrano che tutti i picchi cromatografici presentano buone forme di picchi senza codaLa sensibilità soddisfa i requisiti sperimentali e il coefficiente di correlazione (R) è superiore a 0.999La ripetibilità a basse, medie e alte concentrazioni è entro il 5% e non si osserva alcun riporto del sistema dopo l'iniezione di campioni ad alta concentrazione.Questi risultati indicano che il metodo, quando è dotato del sistema Wayeal di cromatografia liquida e spettrometria di massa in tandem, soddisfa i requisiti per l'analisi qualitativa e quantitativa di routine dei campioni bersaglio.