Determinazione dei residui di β-agonisti nella carne suina mediante sistema di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem Wayeal LCMS-TQ9200

Questo esperimento si riferisce a "GB 31658.22-2022 Standard nazionale per la sicurezza alimentare — Determinazione dei residui di β-agonisti negli alimenti di origine animale mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem" e utilizza il sistema di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem Wayeal LCMS-TQ9200 per determinare il contenuto di β-agonisti nella carne di maiale. I risultati sperimentali indicano che il test di idoneità del sistema ha dimostrato picchi ben definiti e una buona linearità, soddisfacendo i requisiti sperimentali. La ripetibilità del tempo di ritenzione per la soluzione standard di lavoro degli β-agonisti era inferiore all'1% e la ripetibilità dell'area del picco era inferiore al 3%, indicando una buona ripetibilità. Per la soluzione di test di sensibilità degli β-agonisti, i rapporti segnale-rumore dei picchi principali a concentrazioni di 0,2 ng/mL e 0,5 ng/mL erano significativamente superiori a 3 e 10, rispettivamente, soddisfacendo i requisiti sperimentali.

Non sono stati rilevati β-agonisti nel test del campione di carne di maiale. Tutti i dati sopra riportati soddisfano i requisiti dello strumento specificati dal metodo standard.

Parole chiave:Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem; β-agonisti; Clenbuterolo; Sicurezza alimentare.

1. Strumenti e reagenti

1.1 Elenco di configurazione LCMS

Tabella 1 Elenco di configurazione dello strumento

1.2 Reagenti e standard

Tabella 2 Elenco dei reagenti e degli standard

1.3 Materiale sperimentale e attrezzature ausiliarie

Pulitore a ultrasuoni

Miscelatore a vortice

Agitatore a temperatura costante a bagno termostatico

Centrifuga ad alta velocità

2. Metodo sperimentale

2.1 Pretrattamento del campione

2.1.1 Idrolisi enzimatica ed estrazione

Pesare 2 g del campione (con precisione di ±0,05 g) in una provetta da centrifuga da 50 mL. Aggiungere 6 mL di soluzione tampone di acetato di ammonio 0,2 mol/L e 40μL di β-glucuronidasi/arilsulfatasi. Miscelare accuratamente con un vortice e incubare a 37°C al buio con agitazione in un bagno termostatico per 16 ore. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente per l'uso successivo.

2.1.2 Estrazione, purificazione e concentrazione

Prelevare la soluzione preparata, aggiungere 100μL della soluzione di lavoro dello standard interno a 100 ng/mL, miscelare accuratamente con un vortice e centrifugare a 8000 giri/min per 8 minuti. Raccogliere il surnatante, aggiungere 5 mL di soluzione di acido perclorico 0,1 mol/L, miscelare con un vortice e regolare il pH a 1,0 ± 0,2 utilizzando acido perclorico. Dopo la centrifugazione a 8000 giri/min per 8 minuti, regolare il pH del surnatante a 10 ± 0,5 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio 10 mol/L. Aggiungere 15 mL di acetato di etile, agitare a velocità media per 5 minuti e centrifugare a 5000 giri/min per 5 minuti. Raccogliere lo strato organico superiore. Allo strato acquoso rimanente, aggiungere 10 mL di metil etere terz-butilico, agitare a velocità media per 5 minuti, centrifugare a 5000 giri/min per 5 minuti e raccogliere lo strato organico superiore. Combinare tutti gli strati organici ed evaporare a secco sotto un flusso di azoto a 50°C. Sciogliere il residuo in 5 mL di soluzione di acido formico al 2% e mettere da parte. Preparare una colonna di estrazione in fase solida a scambio cationico a modalità mista attivandola sequenzialmente con 3 mL di metanolo e 3 mL di acido formico al 2%. Caricare la soluzione preparata sulla colonna, risciacquare sequenzialmente con 3 mL di acido formico al 2% e 3 mL di metanolo e asciugare sotto vuoto. Eluire la colonna con 3 mL di soluzione di metanolo ammoniacale al 5%. Evaporare l'eluato a secco sotto un flusso di azoto a 50°C. Ridissolvere il residuo in 0,5 mL di soluzione di metanolo–acido formico allo 0,1% (10:90, v/v), miscelare accuratamente e filtrare attraverso una membrana microporosa da 0,22μm per l'analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem.

2.2 Condizioni sperimentali

2.2.1 Condizioni cromatografiche liquide

Colonna cromatografica” C18, 1,8μm 2,1*100mm

Fase mobile: A: Acido formico allo 0,1% in acqua; B: Metanolo

Portata: 0,3 mL/min

Temperatura della colonna: 40°C

Volume di iniezione: 3μL

3. Test di idoneità del sistema

Il test di idoneità del sistema mostra che i picchi target sono ben definiti senza interferenze da altri picchi di impurità, soddisfacendo i requisiti sperimentali.

Fig. 1 Cromatogramma del test dei sette β-agonisti (1 ng/mL)

3.2 Intervallo lineare

Prendendo soluzioni standard di β-agonisti e utilizzando soluzioni di lavoro a concentrazione intermedia, è stata preparata una curva standard a gradini. L'intervallo lineare per i sette β-agonisti era 0,5–50 ng/mL, con R² > 0,99, indicando una buona relazione lineare.

Tabella 3 Tabella degli intervalli lineari per gli β-agonisti

Fig. 2 Cromatogramma della curva standard dei sette β-agonisti

3.3 Limite di rilevamento (LOD) e limite di quantificazione (LOQ)

In questo metodo, il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) per gli β-agonisti sono impostati rispettivamente a 0,2 ng/mL e 0,5 ng/mL. Per ogni composto in questo metodo, il rapporto segnale-rumore alle concentrazioni specificate per LOD e LOQ è superiore a 3 e 10, rispettivamente, soddisfacendo i requisiti di sensibilità sperimentale.

Tabella 4 Rapporti segnale-rumore corrispondenti per LOD e LOQ di ciascun composto

Fig. 3 Cromatogrammi ionici dei sette β-agonisti alla concentrazione LOD e LOQ

3.4 Test di precisione

È stata prelevata una soluzione mista di sostanze standard di β-agonisti a concentrazioni basse, medie e alte e iniettata consecutivamente sei volte per confrontare le deviazioni del tempo di ritenzione e dell'area del picco. I risultati sono mostrati nella tabella sottostante. Tutti gli β-agonisti hanno mostrato deviazioni del tempo di ritenzione inferiori all'1% e deviazioni dell'area del picco inferiori al 3%, soddisfacendo i requisiti sperimentali.

Tabella 5 Test di precisione per ciascun composto

Fig. 4 Cromatogrammi dei test di precisione dei sette β-agonisti (6 iniezioni)

3.5 Test del campione

I campioni di carne di maiale acquistati sul mercato sono stati testati secondo il metodo di pretrattamento menzionato e non sono stati rilevati β-agonisti. Non sono stati osservati picchi cromatografici ai tempi di ritenzione corrispondenti ai sette β-agonisti, mentre gli altri picchi rappresentano i segnali della matrice dopo l'idrolisi enzimatica.

Fig. 5 Cromatogramma del test del campione di carne di maiale

4. Conclusione

Questo metodo utilizza il sistema di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem Wayeal LCMS-TQ9200 per la determinazione degli β-agonisti nella carne di maiale. I dati dimostrano che tutti i picchi cromatografici mostrano una buona forma senza coda, la sensibilità soddisfa i requisiti sperimentali, i coefficienti di correlazione lineare superano 0,99 e la precisione è soddisfacente con deviazioni del tempo di ritenzione inferiori all'1% e deviazioni dell'area del picco entro il 3% per sei iniezioni consecutive di ciascun composto. Non sono stati rilevati β-agonisti nei test del campione di carne di maiale. Questi risultati indicano che il metodo, dotato del sistema Wayeal LC-MS/MS, soddisfa i requisiti di rilevamento qualitativo e quantitativo di routine per gli analiti target.