Determinazione dei residui di antibiotici amfenicoli nella carne di pollo mediante LCMS-TQ9200 Wayeal

Parole chiave: LCMS, amfenicoli, sicurezza alimentare, residui di farmaci veterinari.

1. Strumenti e reagenti

1.1 Elenco configurazione LCMS

Tabella 1 Elenco configurazione strumenti

1.3 Materiali sperimentali e attrezzature ausiliarie

Pulitore ad ultrasuoni

Miscelatore a vortice

Evaporatore ad azoto a bagnomaria

Centrifuga ad alta velocità

2. Metodi sperimentali

2.1 Preparazione della soluzione

2.1.1 Soluzione di acetato di etile ammoniacale al 2%: Prelevare 4 mL di acqua ammoniacale e diluirli a 200 mL con acetato di etile.

2.1.2 Soluzione di cloruro di sodio al 4%: Prelevare 4 g di cloruro di sodio, scioglierli in acqua e diluire a 100 mL.

2.1.3 Soluzione di n-esano satura di cloruro di sodio al 4%: Prelevare una quantità adeguata di soluzione di cloruro di sodio al 4%, aggiungere un eccesso di n-esano, mescolare, lasciare separare gli strati e prelevare lo strato superiore di n-esano.

2.1.4 Soluzione di lavoro standard interna mista: Prelevare una quantità appropriata della soluzione madre standard interna mista, diluire con metanolo al 20% per ottenere cloramfenicolo-D5 a 10 ng/mL e altri standard interni (florfenicolo-D3, tiamfenicolo-D3 e florfenicolo ammina-D3) a 50 ng/mL ciascuno.

2.2 Pretrattamento del campione

2.2.1 Estrazione del campione: Pesare 2 g di campione (con una precisione di ±0,01 g), aggiungere 100 µL di soluzione di lavoro standard interna mista, vortex per 1 min, aggiungere 10 mL di soluzione di acetato di etile ammoniacale al 2%, vortex per 10 min, centrifugare a 8000 rpm per 5 min e raccogliere il surnatante. Aggiungere altri 10 mL di soluzione di acetato di etile ammoniacale al 2% al residuo e ripetere la procedura di estrazione. Combinare i due surnatanti, evaporare a secco sotto un flusso di azoto a 50°C e conservare per l'uso.

2.2.2 Purificazione del campione: Aggiungere 3 mL di soluzione di cloruro di sodio al 4% al residuo di purificazione, vortex per sciogliere, quindi aggiungere 5 mL di soluzione di n-esano satura di cloruro di sodio al 4%, vortex per 30 s, centrifugare a 8000 rpm per 5 min e scartare lo strato superiore di n-esano. Ripetere la procedura di sgrassaggio una volta. Aggiungere 5 mL di soluzione di acetato di etile ammoniacale al 2%, vortex per 10 min, centrifugare a 8000 rpm per 5 min e raccogliere il surnatante. Aggiungere altri 5 mL di soluzione di acetato di etile ammoniacale al 2% al residuo e ripetere la procedura di estrazione. Combinare i surnatanti, evaporare a secco sotto un flusso di azoto a 50°C, aggiungere 1 mL di soluzione di metanolo al 20%, vortex per 30 s, filtrare attraverso una membrana e attendere l'analisi strumentale.

2.3 Condizioni sperimentali

2.3.1 Condizioni di cromatografia liquida

Colonna cromatografica: C18 1,7μm 2,1x50mm

Fase mobile: A: Acetonitrile; B: 2 mM Formiato di ammonio in acqua

Portata: 0,3 mL/min

Temperatura della colonna: 40 ℃

Volume di iniezione: 5µL

2.3.2 Condizioni di spettrometria di massa

Tabella 3 Parametri della sorgente ionica

3. Risultato dell'esperimento

3.1 Cromatogramma standard

La determinazione dei quattro antibiotici amidici e dei loro standard interni è stata completata entro 6 minuti. Tutti i picchi hanno mostrato buone forme di picco senza coda e ogni composto ha dimostrato una risposta soddisfacente, soddisfacendo i requisiti sperimentali.

Fig. 1 Cromatogramma di 4 antibiotici amfenicoli e standard interno (cloramfenicolo 0,2 ng/mL, altri antibiotici 1 ng/mL)

3.2 Intervallo lineare

Prelevare una quantità appropriata della soluzione standard mista di alcol amidico e diluirla gradualmente a una serie di concentrazioni per preparare una curva standard. Per l'analisi quantitativa è stato utilizzato il metodo dello standard interno isotopico. L'intervallo lineare era 0,2-10 ng/mL per il cloramfenicolo e 1-50 ng/mL per la florfenicolo ammina, il tiamfenicolo e il florfenicolo. La deviazione tra i risultati di rilevamento lineare e le concentrazioni note era inferiore alla deviazione massima consentita, con valori R² compresi tra 0,9958 e 0,9998, indicando un'eccellente linearità per tutti i componenti.

Tabella 4 Intervallo lineare dei composti

Fig. 2 Dati della curva di calibrazione dei quattro composti

3.3 LOD e LOQ

Lo standard nazionale cinese per la sicurezza alimentare GB 31658.20-2022 specifica che per questo metodo, il limite di rilevamento (LOD) per il cloramfenicolo è 0,1µg/kg e il limite di quantificazione (LOQ) è 0,2µg/kg; mentre per il tiamfenicolo, il florfenicolo e la florfenicolo ammina, l'LOD è 0,5µg/kg e l'LOQ è 1 µg/kg. I rapporti segnale-rumore per tutti i composti target alle concentrazioni specificate del limite di rilevamento (LOD) e del limite di quantificazione (LOQ) sono significativamente maggiori di 3 e 10, il che è conforme ai requisiti di sensibilità specificati nello standard nazionale.

Tabella 5 Limiti di rilevamento e quantificazione per ciascun composto

Fig. 3 Cromatogrammi dei limiti di rilevamento e dei limiti di quantificazione per quattro composti

3.4 Test di precisione

Prelevare concentrazioni basse, medie e alte di soluzioni miste standard di amfenicoli ed eseguire sei iniezioni consecutive per confrontare le deviazioni nel tempo di ritenzione e nell'area del picco. I risultati sono mostrati nella tabella sottostante. Le deviazioni del tempo di ritenzione di tutti i composti amfenicolici erano inferiori all'1% e le deviazioni dell'area del picco erano inferiori al 5%, soddisfacendo il requisito di precisione di RSD ≤ 15% specificato dallo standard nazionale.

Tabella 6 Test di precisione per ciascun composto

Fig. 4 Cromatogrammi di precisione di quattro composti alcolici amidici

3.5 Test di recupero con aggiunta di matrice

L'accuratezza di questo metodo di rilevamento è stata valutata utilizzando un test di recupero con aggiunta. Aggiungere concentrazioni note di campioni standard al campione di matrice in bianco a diversi rapporti per il pretrattamento, preparando campioni con aggiunta di matrice a concentrazioni alte, medie e basse. Ogni livello di concentrazione dei campioni con aggiunta è stato analizzato indipendentemente sei volte. Il tasso di recupero è stato calcolato confrontando la concentrazione rilevata nella matrice prima e dopo l'aggiunta, valutando così l'accuratezza del metodo. I risultati sono mostrati come segue: nella matrice di pollo, i tassi di recupero con aggiunta di tutti i composti variavano dal 94,5% al 107,2%, con un CV entro il 5%, indicando che l'accuratezza soddisfa i requisiti del metodo.

Tabella 6 Tassi di recupero dei composti nella matrice di pollo con aggiunta

3.6 Test del campione

Campioni di petto di pollo acquistati casualmente nei supermercati sono stati estratti e purificati utilizzando il suddetto metodo di pretrattamento del campione. Dopo aver testato i campioni sullo strumento, nessuno dei quattro antibiotici amidici è stato rilevato.

Fig. 5 Cromatogramma di quattro composti alcolici amidici in campioni di petto di pollo del supermercato

4. Conclusione

Questo metodo utilizza il sistema di spettrometria di massa a cromatografia liquida LCMS-TQ9200 di Wayeal per la determinazione degli antibiotici amfenicoli negli alimenti di origine animale, consentendo l'acquisizione simultanea di composti sia in modalità ioni positivi che negativi. I dati indicano che il metodo fornisce picchi cromatografici ben formati senza coda e la sua sensibilità soddisfa i requisiti dello standard nazionale. I coefficienti di correlazione lineare sono tutti superiori a 0,99. La deviazione del tempo di ritenzione per tutti i composti in sei iniezioni consecutive è entro l'1% e la deviazione dell'area del picco è entro il 5%, dimostrando una buona precisione. I tassi di recupero con aggiunta nella matrice di pollo variano dal 94,5% al 107,2%, con un CV entro il 5%, indicando che l'accuratezza soddisfa i requisiti metodologici. Sono stati analizzati campioni di petto di pollo acquistati casualmente nei supermercati e nessuno dei quattro antibiotici amfenicolici è stato rilevato. Ciò dimostra che il metodo, dotato del sistema di spettrometria di massa a cromatografia liquida di Wayeal, soddisfa i requisiti per il rilevamento qualitativo e quantitativo di routine dei campioni target.