Determinazione del contenuto di caffeina nelle bevande mediante cromatografia liquida

La caffeina è un alcaloide metilxantinico naturale ampiamente presente in materie prime come chicchi di caffè, foglie di tè e semi di cacao. Serve come additivo funzionale di base e composto aromatico caratteristico nelle bevande disponibili in commercio, tra cui bevande gassate, bevande energetiche, bevande a base di tè e bevande al caffè. Un'assunzione moderata di caffeina può esercitare effetti fisiologici come rinfrescare la mente e alleviare la fatica. Tuttavia, un consumo eccessivo e a lungo termine può facilmente indurre reazioni avverse, tra cui palpitazioni, insonnia e ipereccitabilità nervosa. Inoltre, le popolazioni suscettibili, come le donne in gravidanza, i bambini e gli individui con malattie cardiovascolari, hanno soglie di tolleranza ancora più basse. Di conseguenza, gli standard di sicurezza alimentare in vari paesi hanno stabilito chiari limiti normativi sul contenuto di caffeina nelle bevande.

In Cina, lo standard nazionale di sicurezza alimentare intitolato "Determinazione della caffeina nelle bevande" (GB 5009.139-2014) funge da base legale per la determinazione quantitativa della caffeina nelle matrici di bevande. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), grazie alla sua eccellente risoluzione, alla forte capacità di resistere alle interferenze della matrice e all'elevata accuratezza quantitativa, è diventata il metodo di scelta per l'analisi di campioni a matrice complessa, tra cui varie bevande composte, bevande contenenti latte e bevande funzionali a base di erbe. Questo esperimento è stato condotto in conformità con il metodo della cromatografia liquida ad alte prestazioni specificato nello standard nazionale GB 5009.139-2014, stabilendo un protocollo di pretrattamento del campione e di separazione/rilevamento cromatografico liquido per campioni di bevande, e realizzando l'identificazione qualitativa e l'analisi quantitativa della caffeina in diversi tipi di bevande.

Parole chiave: cromatografia liquida ad alte prestazioni; caffeina; bevande; determinazione del contenuto.

1. Strumenti e Reagenti

1.1 Elenco configurazione sistema di cromatografia liquida

Tabella 1. Elenco configurazione strumenti

1.2 Elenco reagenti e standard

Tabella 2. Elenco reagenti e standard

1.3 Materiali sperimentali e attrezzature ausiliarie

Bagno a ultrasuoni;

Agitatore vortex;

Membrana filtrante acquosa microporosa da 0,45 μm.2.1 Preparazione delle soluzioni standard

2.1.1 Soluzione madre standard di caffeina (2,0 mg/mL): pesare accuratamente 20 mg di standard di riferimento di caffeina (con precisione di 0,1 mg) in un matraccio tarato da 10 mL, sciogliere e portare a volume con metanolo. Conservare in frigorifero a 4 °C. La durata di conservazione è di 6 mesi.

2.1.2 Soluzione intermedia standard di caffeina (200 μg/mL): trasferire accuratamente 5,0 mL della soluzione madre standard di caffeina (2.1.1) in un matraccio tarato da 50 mL e portare a volume con acqua. Conservare in frigorifero a 4 °C. La durata di conservazione è di 1 mese.

2.1.3 Soluzioni standard di lavoro di caffeina per curva di calibrazione: trasferire 0,5 mL, 1,0 mL, 2,0 mL, 5,0 mL e 10,0 mL della soluzione intermedia standard di caffeina (2.1.2) in rispettivi matracci tarati da 10 mL e portare a volume con acqua. Le concentrazioni risultanti di questa serie di standard sono rispettivamente 10,0 μg/mL, 20,0 μg/mL, 40,0 μg/mL, 100 μg/mL e 200 μg/mL. Preparare immediatamente prima dell'uso.2842.3042.2.1 Bevande tipo Cola

(a) Degasaggio: sonicare il campione utilizzando un bagno a ultrasuoni a 40 °C per 5 minuti.2.2.2 Caffè liquido contenente latte e prodotti a base di tè2842.3042.3 Condizioni sperimentali

2.3.1 Condizioni cromatograficheFase mobile: Metanolo/acqua = 24/76 (v/v)Temperatura colonna: 25 °CVolume di iniezione: 10 μL3.1 Bianco3.2 Intervallo lineare

Fig 2. Risultati di linearità dello standard di riferimento di caffeina

Tabella 3. Intervallo di linearità dello standard di riferimento di caffeina

Analita2842.304Coefficiente di correlazione (R)

Caffeina

10–200

1.00000

3.3 Ripetibilità

Fig 3. Cromatogrammi di ripetibilità dello standard di riferimento di caffeina (n = 6)

Tabella 4. Parametri cromatografici di ripetibilità per lo standard di riferimento di caffeina (n = 6)N.Nome campioneArea del picco (mAU·s)

1

Caffeina 100μg/mL

7.1922842.3042

7.167

2843.2237.158

2846.331

4

7.167

2841.149

5

7.167

2843.641

DS

0.014

18.572

n.d.

3

n.d.

3

10401

1.158Tabella 8. Risultati cromatografici per recupero per aggiunta in un campione di bevanda tè al latte di una certa marca (Concentrazione di aggiunta: 40μg/mL)

94.99%Tabella 8. Risultati cromatografici per recupero per aggiunta in un campione di bevanda tè al latte di una certa marca (Concentrazione di aggiunta: 40μg/mL)

3

Caffeina

Rapporto segnale/rumore

Concentrazione calcolata

Limite di rilevamento (mg/kg)