Determinazione dei residui di eritromicina nei residui di fermentazione antibiotica utilizzando il sistema di spettrometria di massa a cromatografia liquida Wayeal LCMS-TQ9200

L'eritromicina è un antibiotico macrolide prodotto dalla fermentazione di Streptomyces erythreus. Esercita il suo effetto antibatterico principalmente inibendo la sintesi proteica batterica. La produzione di eritromicina si basa principalmente sulla tecnologia di bio-fermentazione, che prevede fasi come la selezione del ceppo, la coltura di seme, la fermentazione su larga scala in serbatoi, l'estrazione e la purificazione. Dopo la fermentazione, l'eritromicina viene estratta con solventi organici (come l'acetato di butile), seguita dalla purificazione mediante cristallizzazione o separazione con resine a scambio ionico, ottenendo infine sali di grado clinico (ad esempio, etilsuccinato di eritromicina). Tuttavia, il processo di produzione dell'eritromicina genera una quantità significativa di residui miceliali (residui di fermentazione), che possono contenere antibiotici residui, proteine microbiche e sottoprodotti metabolici. Se non gestiti correttamente, questi residui possono entrare nella catena ecologica attraverso lo scarico ambientale o l'uso come additivi per mangimi, causando molteplici pericoli: l'eritromicina residua può favorire la diffusione dei geni di resistenza agli antibiotici nel suolo e nei corpi idrici, interrompendo l'equilibrio della comunità microbica; amplificata attraverso la catena alimentare, può indurre l'emergere di ceppi batterici resistenti negli animali o negli umani, minando l'efficacia degli antibiotici; inoltre, la materia organica non utilizzata all'interno dei residui può causare inquinamento ambientale. Pertanto, una rigorosa regolamentazione dei residui miceliali è una misura critica per il controllo dell'inquinamento derivante dalla produzione di eritromicina.

Questo esperimento è stato condotto con riferimento allo standard "T/PIAC 00003—2021 Group Standard of China Pharmaceutical Industry Association - Metodo per la determinazione dell'eritromicina nei residui di antibiotici, nei materiali di base dei fertilizzanti organici, nelle colture e nei mezzi ambientali", utilizzando il sistema di spettrometria di massa a cromatografia liquida Wayeal LCMS-TQ9200 per determinare il contenuto di eritromicina nei residui miceliali. I risultati sperimentali indicano che il test di idoneità del sistema ha dimostrato una buona forma del picco e una buona linearità, soddisfacendo i requisiti sperimentali.

1. Strumenti e reagenti

1.1 Elenco di configurazione LCMS

Tabella 1 Elenco della configurazione dello strumento

1.2 Reagenti e standard

Tabella 2 Elenco dei reagenti e degli standard

1.3 Materiale sperimentale e attrezzature ausiliarie

Pulitore a ultrasuoni

Miscelatore a vortice

Centrifuga ad alta velocità

2. Metodo sperimentale

2.1 Pretrattamento del campione

Pesare 0,5 g del campione (con precisione di 0,001 g) in una provetta con tappo di vetro. Aggiungere 50 ml di acetonitrile, vorticare per 1 minuto per omogeneizzare la miscela ed eseguire l'estrazione assistita da ultrasuoni per 20 minuti. Quindi trasferire la miscela in una provetta da centrifuga da 50 ml e centrifugare a 4000 giri/min per 10 minuti. Raccogliere una quantità appropriata di surnatante e farla passare attraverso una membrana filtrante da 0,22μm. Scartare almeno 1 ml del filtrato iniziale, quindi trasferire il filtrato rimanente in una fiala LC ambrata per l'analisi.

2.2 Condizioni sperimentali

2.2.1 Condizioni del metodo di cromatografia liquida

Colonna cromatografica: C18 1,7μm 2,1x50mm

Fase mobile: A: Acetonitrile, B: 0,1% Acido formico in acqua

Portata: 0,3 ml/min

Temperatura della colonna: 30℃

Volume di iniezione: 2μL

2.2.2 Condizioni del metodo dello spettrometro di massa

Tabella 3 Parametri della sorgente ionica della spettrometria di massa

3. Risultato dell'esperimento

3.1 Test di idoneità del sistema

I risultati del test di idoneità del sistema hanno mostrato picchi target ben definiti senza interferenze da picchi estranei, soddisfacendo tutti i requisiti sperimentali.

Fig. 1 Cromatogramma della soluzione di lavoro standard di eritromicina A (0,5 ng/ml)

3.2 Intervallo lineare

La curva di calibrazione per l'eritromicina A è stata preparata diluendo in serie la soluzione standard utilizzando soluzioni di lavoro a concentrazione intermedia. La curva ha dimostrato un'eccellente linearità nell'intervallo di 0,5-500 ng/ml, con un coefficiente di correlazione (R²) superiore a 0,99.

Tabella 4 Intervallo lineare di eritromicina A

Fig. 2 Curva di calibrazione per eritromicina A

3.3 Limite di rilevamento (LOD) e limite di quantificazione (LOQ)

In questo metodo, il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) per la soluzione standard di eritromicina A sono stati determinati rispettivamente a 0,2 ng/ml e 0,5 ng/ml. I corrispondenti rapporti segnale/rumore (S/N) erano 110,02 e 292,20, superando sostanzialmente i requisiti minimi di 3 e 10, soddisfacendo così i criteri di sensibilità sperimentale.

Figura 3. Cromatogrammi ionici estratti per LOD e LOQ di eritromicina A

3.4 Test di precisione

La soluzione di eritromicina A è stata iniettata consecutivamente sette volte, con i risultati mostrati nella figura sottostante. La deviazione del tempo di ritenzione per l'eritromicina A era dello 0,19% e la deviazione dell'area del picco era dello 0,96%, entrambi inferiori al 5%, soddisfacendo i requisiti sperimentali.

Figura 4. Cromatogrammi di precisione del campione di eritromicina A (7 iniezioni)

3.5 Test del campione

Seguendo il suddetto metodo di pretrattamento, l'area del picco target nel campione solido era di 7,4E6. Calcolato tramite il metodo dello standard esterno, il contenuto di eritromicina A nella soluzione del campione è stato determinato a 400 ng/ml.

Fig. 5 Cromatogramma del test del campione di eritromicina A

4. Conclusione

Questo metodo utilizza il sistema di spettrometria di massa a cromatografia liquida Wayeal LCMS-TQ9200 per la determinazione del contenuto di eritromicina A nei residui di fermentazione antibiotica. I dati indicano che il metodo dimostra prestazioni eccellenti: tutti i picchi cromatografici mostrano una forma ottimale senza coda e la sensibilità soddisfa i requisiti sperimentali. Il coefficiente di correlazione lineare (R²) supera 0,99. Le deviazioni del tempo di ritenzione e dell'area del picco per tutti i composti in sette iniezioni consecutive sono entro l'1%, indicando un'elevata precisione. I cromatogrammi del campione non mostrano interferenze da picchi estranei e il contenuto del campione misurato è di 400 ng/ml. Questo metodo, dotato del sistema Wayeal LC-MS/MS, soddisfa i requisiti per l'analisi qualitativa e quantitativa di routine dei campioni di prova.