Determinazione della rodamina B nella polvere di peperoncino con il sistema WAYEAL LCMS-TQ9200 LCMS/MS

La Rodamina B (nota anche come Rosso Rosa B o Violetto Basico 10) è un colorante fluorescente basico sintetico appartenente alla classe chimica delle xantene. Questa sostanza di per sé presenta un brillante colore rosso-rosa ed è facilmente solubile in solventi polari come acqua ed etanolo. Inizialmente, era ampiamente utilizzata in campi industriali tra cui tessile, stampa ed etichettatura fluorescente. A causa del suo basso costo e della sua forte capacità colorante, alcuni commercianti senza scrupoli l'hanno aggiunta illegalmente ai prodotti alimentari a scopo di colorazione, come peperoncino in polvere, pepe di Sichuan, prodotti a base di carne e condimenti, rendendola un importante contaminante che mette a rischio la sicurezza alimentare.
La Rodamina B è chiaramente tossica per il corpo umano. Può entrare nel corpo attraverso il tratto digestivo o la pelle, interferendo con il normale metabolismo fisiologico. Inoltre, presenta potenziali rischi cancerogeni e mutageni. Di conseguenza, è stata classificata come sostanza non commestibile proibita negli alimenti da diversi paesi. È un obiettivo chiave della supervisione della sicurezza alimentare e il suo tasso di rilevamento rimane persistentemente elevato in vari condimenti e alimenti trasformati.

In questa nota applicativa, è stato stabilito un metodo di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per la determinazione della Rodamina B negli alimenti utilizzando il sistema di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem WAYEAL LCMS-TQ9200. Questo metodo raggiunge un'efficiente estrazione, una precisa separazione e una sensibile quantificazione dell'analita target, eliminando efficacemente le interferenze della matrice alimentare. Offre un supporto tecnico affidabile per lo screening rapido e la quantificazione accurata della Rodamina B negli alimenti, facilitando così un'efficace supervisione della sicurezza alimentare.

Parole chiave: Sicurezza alimentare, Rodamina B, LCMS/MS

1. Strumenti e Reagenti

1.1 Configurazione dello Strumento

Tabella 1 Elenco Configurazione Strumento

1.2 Elenco Reagenti e Standard

Tabella 2 Elenco Reagenti e Standard

1.3 Materiale Sperimentale e Attrezzature Ausiliarie

Agitatore Vortex

Centrifuga ad alta velocità

Bilancia analitica

Manifold per estrazione in fase solida (SPE) (con pompa per vuoto)

Evaporatore a azoto

Agitatore orbitale

2. Metodo Sperimentale

2.1 Preparazione Soluzioni

2.1.1 0.1% Acido Formico in Acqua: Trasferire 1 mL di acido formico in 500 mL di acqua, mescolare accuratamente e portare a un volume finale di 1000 mL con acqua.

2.1.2 0.1% Acido Formico in Acetonitrile: Trasferire 1 mL di acido formico in 500 mL di acetonitrile, mescolare accuratamente e portare a volume 1000 mL con acetonitrile.

2.1.3 50% Metanolo in Acqua: Trasferire accuratamente 500 mL di metanolo in un matraccio tarato da 1 L, quindi portare a volume con acqua.

2.1.4 50% Metanolo in Acqua con 0.1% Acido Formico: Trasferire 1 mL di acido formico in 500 mL di soluzione al 50% di metanolo in acqua, mescolare accuratamente e diluire a volume 1000 mL con soluzione al 50% di metanolo in acqua.

2.1.5 5% Ammoniaca in Metanolo: Trasferire 5 mL di soluzione di ammoniaca in un matraccio tarato da 100 mL, diluire a volume con metanolo e mescolare accuratamente.

2.2 Pretrattamento Campione

2.2.1 Estrazione Campione

Pesare accuratamente 1 g di campione di peperoncino in polvere in una provetta da centrifuga di plastica da 50 mL. Aggiungere accuratamente 10,0 mL di soluzione acquosa di metanolo al 50% contenente 0,1% di acido formico e mescolare bene. Aggiungere due omogeneizzatori ceramici, quindi agitare per 15 minuti su un agitatore vortex. Centrifugare a 8000 giri/min per 10 minuti. Trasferire 3 mL del surnatante (strato di estrazione) e filtrare attraverso una membrana filtrante per fase organica da 0,45 μm prima della purificazione.

2.2.2 Purificazione Campione

Condizionamento Cartuccia per Estrazione in Fase Solida (SPE) NovaPre MCX: Prima dell'uso, attivare sequenzialmente la cartuccia con 3 mL di metanolo e 3 mL di acqua.

Trasferire accuratamente 1,0 mL dell'estratto sulla cartuccia per estrazione in fase solida (SPE) NovaPre MCX. Lavare sequenzialmente la cartuccia con 3 mL di acido formico allo 0,1% in acqua, 3 mL di acqua e 3 mL di metanolo. Eluire l'analita target con 6 mL di soluzione di ammoniaca in metanolo e raccogliere l'eluato. Evaporare l'eluato quasi a secchezza sotto un flusso di azoto a 45 °C. Sciogliere il residuo in 0,5 mL della fase mobile iniziale, filtrare attraverso una membrana filtrante per fase organica da 0,22 μm, quindi iniettare il filtrato per l'analisi strumentale.

2.3 Condizioni Sperimentali

2.3.1 Condizioni HPLC

Colonna cromatografica: C18, 1.7 μm, 2.1*50mm;
Fase mobile: Fase A: acido formico allo 0,1% in acqua; Fase B: acido formico allo 0,1% in acetonitrile;
Velocità di flusso: 0,4 mL/min;
Temperatura colonna: 40 °C;
Volume di iniezione: 1 μL.

2.3.2 Condizioni Spettrometria di Massa

Tabella 3 Parametri Spettrometria di Massa Composti

Nota: * Ione quantificatore.

3. Risultati Sperimentali

3.1 Cromatogramma Standard

La rilevazione della Rodamina B è stata completata entro 7 minuti. Come mostrato nella Figura 1, il picco del composto ha mostrato una buona forma del picco e una risposta soddisfacente, soddisfacendo i requisiti per la determinazione sperimentale.

Fig 1 Cromatogramma della Rodamina B

3.2 Intervallo Lineare

Una quantità appropriata di soluzione standard di lavoro di Rodamina B è stata accuratamente trasferita e diluita con la fase mobile iniziale per preparare la curva standard. L'intervallo lineare era 0.1–10 ng/mL. La deviazione tra i risultati lineari e le concentrazioni note era entro la deviazione massima ammissibile. Il coefficiente di determinazione (R²) era maggiore di 0,999, indicando una buona linearità.

Fig 2 Curva Standard Rodamina B

3.3 Limite di Quantificazione e Limite di Rilevazione

In questo metodo, il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) per la Rodamina B sono stati stabiliti rispettivamente a 0,1 ng/mL e 0,5 ng/mL. I rapporti segnale-rumore (S/N) corrispondenti sono riassunti nella tabella sottostante. I rapporti S/N al LOD hanno superato 3, mentre quelli al LOQ hanno superato 10.

Tabella 4 Limite di Quantificazione e Limite di Rilevazione

Fig 3 Rapporto Segnale-Rumore al LOD per Rodamina B (0.1ng/mL)

Fig 4 Rapporto Segnale-Rumore al LOQ per Rodamina B (0.5ng/mL)

3.4 Ripetibilità

Soluzioni standard a tre concentrazioni (0,5, 2 e 5 ng/mL) sono state iniettate sei volte consecutivamente. I risultati sono mostrati nella tabella sottostante. Le deviazioni standard relative (RSD) del tempo di ritenzione e dell'area del picco per la Rodamina B a concentrazioni basse, medie e alte erano tutte entro il 5%, soddisfacendo i requisiti sperimentali.

Tabella 5. Test di Ripetibilità per Rodamina B a Concentrazioni Basse, Medie e Alte

Fig 5 Cromatogrammi di 6 Iniezioni Consecutive di Rodamina B 0.5ng/mL

Fig 6 Cromatogrammi di 6 iniezioni consecutive di Rodamina B 2ng/mL

Fig 7 Cromatogrammi di 6 iniezioni consecutive di Rodamina B 5ng/mL

3.5 Recupero Spike

Il campione A è stato arricchito con una soluzione standard per aumentare la concentrazione di Rodamina B di 2 ng/mL. Sono state quindi analizzate sei iniezioni replicate. Il recupero ottenuto è stato del 105,7% con un RSD dell'1,473%, soddisfacendo i criteri di accettazione del metodo.

3.6 Carryover

Dopo l'iniezione della soluzione standard da 10 ng/mL, è stato iniettato un solvente bianco per valutare il carryover. I risultati sono mostrati nella figura sottostante. Il carryover nel bianco era inferiore al 10% dello standard di calibrazione più basso (0,1 ng/mL), soddisfacendo i requisiti sperimentali.

Fig 8 Cromatogramma Bianco del Composto

3.7 Test Campione

La concentrazione di Rodamina B nel Campione A era inferiore al limite di rilevazione del metodo (MDL).

Fig 9 Cromatogramma della Rodamina B nel Campione A

4. Conclusione

In questo studio, è stato stabilito un metodo di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per la determinazione della Rodamina B utilizzando il sistema WAYEAL LCMS-TQ9200. I dati ottenuti hanno dimostrato che il metodo ha prodotto picchi cromatografici con buona simmetria e senza coda, e la sensibilità ha soddisfatto i requisiti sperimentali. Il coefficiente di determinazione (R²) era maggiore di 0,999, soddisfacendo i criteri di linearità. La ripetibilità (RSD) a concentrazioni basse, medie e alte era entro il 5%, e il carryover nel bianco era inferiore al 10% dello standard di calibrazione più basso. Questi risultati indicano che il metodo, se accoppiato al sistema WAYEAL LC-MS/MS, è in grado di soddisfare i requisiti di rilevamento qualitativo e quantitativo di routine per gli analiti target.