Il rivelatore di dispersione luminosa evaporativa (ELSD) è un nuovo rivelatore di massa con applicabilità teorica a qualsiasi composto in grado di formare particelle gassose.L'edizione 2025 della Farmacopea specifica l'uso della rilevazione di dispersione luminosa evaporativa (ELSD) per l'analisi e il controllo qualitativo di oltre 100 varietà di farmaci.In pratica, l'ELSD è più frequentemente applicato a composti privi di assorbimento ultravioletto (UV), quali astragaloside, carboidrati, aminoglicosidi e colesterolo.spesso utilizzato come metodo di rilevamento complementare ai rivelatori UV e fluorescentiTuttavia, i risultati dell'ELSD sono influenzati da molteplici fattori, tra cui la composizione della fase mobile, la concentrazione di solvente organico, la modalità di eluzione e le condizioni di nebulosazione.per garantire risultati analitici accurati e coerenti, è essenziale valutare l'impatto di questi fattori sui risultati.
Questo studio, basandosi sul metodo analitico per lo spectinomicina cloridrato della parte II della Farmacopea 2025 e basandosi sui principi ICH QbD,ha utilizzato un progetto sperimentale ortogonale per selezionare e ottimizzare le condizioni analitiche.
Fig. 1 Spectinomicina cloridrato
2Strumento e metodo
In questo studio, l'analisi cromatografica è stata effettuata utilizzando il sistema HPLC della serie LC3200 di Wayeal.un compartimento per colonneIl controllo del sistema e l'acquisizione/elaborazione dei dati sono stati eseguiti con il software di cromatografia SmartLab 2.0.
Tabella 1 Condizioni HPLC
| Colonna di cromatografia |
Nova Atom PC18 (4.6*250 mm, 5 μm) |
| Fase mobile |
0.1mol/l soluzione acquosa di acido trifluoroacetico |
| Densità (mL/min) |
0.6 |
| Temperatura della colonna |
35 |
| Volume di iniezione (μL) |
20 |
| Temperatura del nebulizzatore ELSD (°C) |
85 |
| Temperatura dell'evaporatore ELSD (°C) |
80 |
| ELSD Temperatura di rilevamento (°C) |
50 |
| Tasso di flusso di gas (SLM) |
0.2 |
3Preparazione della soluzione
Soluzione di campione:La soluzione di spectinomicina cloridrato è stata fornita dal cliente con una concentrazione etichettata di 10 mg/ ml e una purezza del 99,8%.
0.1M Soluzione acquosa di acido trifluoroacetico:Pipezzare con precisione 6,8 ml di acido trifluoroacetico in un pallone volumetrico da 1000 ml. Diluire al punto con acqua purificata e mescolare bene. Infine, filtrare sotto vuoto la soluzione attraverso un filtro 0.Filtro a membrana di cellulosa da 45 μm prima dell'uso.
Soluzioni standard:La soluzione di base è stata diluita con acqua purificata per preparare soluzioni di campione con concentrazioni pari a 0.15- 0.25- 0.35- 0.50, e 0,70 mg/ml, rispettivamente. Ogni soluzione è stata quindi filtrata attraverso un filtro a membrana di cellulosa da 0,45 μm prima dell'uso.
4Risultati e discussione
La Farmacopea cinese utilizza condizioni cromatografiche identiche per l'analisi delle sostanze correlate e del contenuto dei componenti principali sotto la voce cloridrato di spectinomicina.Il metodo afferma che "il rivelatore può essere configurato in base alle circostanze reali"Nel corso dello studio, tenuto conto delle caratteristiche strumentali dell'ELSD3260 e dei requisiti del metodo di analisi e della letteratura pertinente,Per lo screening di vari parametri sperimentali è stato utilizzato un progetto sperimentale di Plackett-Burman (tabelle 2 e 3)Successivamente, è stato utilizzato un progetto Box-Behnken (Tabella 4) per ottimizzare la risposta dell'area di picco del rivelatore ELSD.
Tabella 2 Progettazione sperimentale Plackett-Burman
| - No, no, no, no. |
Flusso ((mL/min) |
Temperatura della colonna ((°C) |
Temperatura del nebulizzatore (°C) |
Temperatura dell'evaporatore (°C) |
Temperatura di rilevamento (°C) |
Tasso di flusso di gas (SLM) |
Compensazione dopo la colonna |
| 1 |
0.8 |
35 |
60 |
50 |
50 |
0.4 |
- No, no. |
| 2 |
0.6 |
35 |
50 |
60 |
50 |
0.6 |
- No, no. |
| 3 |
0.6 |
30 |
60 |
60 |
50 |
0.4 |
- Sì, sì. |
| 4 |
0.8 |
30 |
60 |
60 |
40 |
0.6 |
- No, no. |
| 5 |
0.6 |
35 |
60 |
50 |
40 |
0.6 |
- Sì, sì. |
| 6 |
0.8 |
30 |
50 |
50 |
50 |
0.6 |
- Sì, sì. |
| 7 |
0.8 |
35 |
50 |
60 |
40 |
0.4 |
- Sì, sì. |
| 8 |
0.6 |
30 |
50 |
50 |
40 |
0.4 |
- No, no. |
Tabella 3 Analisi ANOVA dei risultati sperimentali di Plackett-Burman
| Fonte di variazione |
Coefficiente |
Valore t |
Valore p |
Significato |
| Tasso di flusso |
- Sei.687 |
- Otto.10 |
< 0.01 |
2 |
| Temperatura della colonna |
0.191 |
0.22 |
0.824 |
6 |
| Temperatura del nebulizzatore (°C) |
5.342 |
6.29 |
< 0.01 |
3 |
| Temperatura dell'evaporatore (°C) |
4.135 |
4.87 |
< 0.01 |
4 |
| Temperatura di rilevamento (°C) |
0.171 |
0.21 |
0.842 |
7 |
| Tasso di flusso di gas (SLM) |
- Dici.381 |
- Dodici.23 |
< 0.01 |
1 |
| Compensazione dopo la colonna |
- Due.559 |
- Tre. Tre.02 |
< 0.01 |
5 |
Come si può vedere dalla tabella 3, il flusso di gas, il flusso di fase mobile e la compensazione post-colonna hanno mostrato effetti negativi.insieme alla compensazione post-colonna disabilitanteTuttavia, la diminuzione della velocità di flusso della fase mobile può portare ad un aumento dell'ampliamento del picco e una ridotta sensibilità di rilevamento.la portata è stata mantenuta in conformità al metodo standardMentre la temperatura della colonna e la temperatura di rilevamento hanno mostrato effetti positivi, non hanno migliorato significativamente il valore di risposta.Gli studi successivi si concentreranno sull'ottimizzazione del flusso di gas, temperatura del nebulizzatore e temperatura dell'evaporatore.
Gli effetti del flusso di gas, della temperatura del nebulizzatore,la temperatura dell'evaporatore sul valore di risposta sono stati studiati utilizzando un progetto sperimentale Box-Behnken all'interno di un quadro di metodologia di superficie di rispostaLa progettazione sperimentale è presentata nella tabella 4.
Tabella 4 Progettazione sperimentale Box-Behnken
| - No, no, no, no. |
Tasso di flusso di gas (SLM) |
Temperatura del nebulizzatore (°C) |
Temperatura dell'evaporatore (°C) |
| 1 |
0.15 |
75 |
80 |
| 2 |
0.15 |
85 |
80 |
| 3 |
0.25 |
75 |
80 |
| 4 |
0.25 |
85 |
80 |
| 5 |
0.15 |
80 |
75 |
| 6 |
0.15 |
80 |
85 |
| 7 |
0.25 |
80 |
75 |
| 8 |
0.25 |
80 |
85 |
| 9 |
0.2 |
75 |
75 |
| 10 |
0.2 |
75 |
85 |
| 11 |
0.2 |
85 |
75 |
| 12 |
0.2 |
85 |
85 |
| 13 |
0.2 |
80 |
80 |
The detection conditions for spectinomycin hydrochloride were determined by simulating the peak area variation using response surface methodology (Figure 2) and considering the instrumental parameter ranges: temperatura del nebulizzatore 85°C, temperatura dell'evaporatore 80°C, temperatura del rivelatore 50°C e portata del gas 0,2 SLM.
A. Effetto del flusso di gas e della temperatura dell'evaporatore sull'area di picco
B. Effetto del flusso di gas e della temperatura del nebulizzatore sull'area di picco
C. Effetto della temperatura del nebulizzatore e della temperatura dell'evaporatore sull'area di picco
Fig. 2 Variazione della zona di picco
Precisione di iniezione
La soluzione di spectinomicina cloridrato è stata diluita a 0,35 mg/ ml e sono state eseguite sei iniezioni consecutive nelle condizioni cromatografiche specificate con cromatogrammi registrati.Sono state calcolate le deviazioni standard relative (RSD%) del tempo di ritenzione e dell' area di picco per il picco cromatografico dello spectinomicina cloridrato.I risultati sono illustrati nella tabella 5.
Tabella 5 Risultati delle prove di precisione di iniezione
| - No, no, no, no. |
Tempo di conservazione (min) |
Aera di picco (SU*s) |
| 1 |
7.625 |
259.124 |
| 2 |
7.615 |
245.223 |
| 3 |
7.618 |
270.250 |
| 4 |
7.608 |
237.267 |
| 5 |
7.627 |
254.977 |
| 6 |
7.613 |
255.548 |
| RSD (%) |
0.09 |
4.49 |
Specificità
In base alle linee guida ICH Q2 ((R2) sulla convalida delle procedure analitiche e al capitolo generale della Farmacopea cinese 9101 Guidelines on Analytical Method Validation,il metodo ottimizzato è stato convalidato per specificità, gamma lineare, precisione e ripetibilità.
L'acqua purificata e la soluzione del campione (0,35 mg/ml) sono state analizzate in parallelo con i cromatogrammi registrati.I risultati (figura 3) non hanno mostrato picchi cromatografici al tempo di ritenzione dello spectinomicina cloridrato nel cromatogramma dell'acqua purificata., mentre il picco di spectinomicina cloridrato nella soluzione del campione ha raggiunto la separazione della linea di base dai picchi adiacenti (R > 1,5).
Fig. 3 Risultati analitici del campione di spectinomicina cloridrato (0,35 mg/ ml)
Intervallo lineare
Preparare tre campioni paralleli di soluzione di base di cloridrato di spectinomicina secondo il metodo standard di preparazione della soluzione, analizzarli in condizioni cromatografiche,e registrare i cromatogrammi. eseguire analisi di regressione utilizzando le aree cromatografiche di picco e le concentrazioni corrispondenti.
Figura 4 Risultati delle prove di linearità (Log-transformed vs. untransformed)
Secondo la letteratura, la relazione tra il valore di risposta ELSD e la concentrazione non è lineare,che richiedono una trasformazione logaritmica sia del valore di risposta che della concentrazione prima di eseguire l'analisi di regressione [8].,9Dopo aver applicato la trasformazione logaritmica ai dati sperimentali, il coefficiente di correlazione della curva di regressione lineare ha superato 0.999, che è significativamente migliore del risultato ottenuto senza trasformazione logaritmica (come mostrato nella figura 4).
Accuratezza e ripetibilità
La soluzione di base di cloridrato di spectinomicina è stata diluita a concentrazioni pari a 0.25- 0.35Per ogni concentrazione sono stati preparati tre campioni paralleli, analizzati nelle condizioni cromatografiche specificate e registrati i cromatogrammi.Il contenuto è stato calcolato utilizzando la curva di regressioneI risultati sono riportati nella tabella 6.
Tabella 6 Risultati dei test di recupero
| - No, no, no, no. |
Valore effettivo (mg/Ml) |
Valore calcolato (mg/Ml) |
Recupero (%) |
RSD di recupero (%) |
| 1 |
0.25 |
0.252 |
100.8 |
1.36
|
| 2 |
0.25 |
0.251 |
100.4 |
| 3 |
0.25 |
0.246 |
98.4 |
| 4 |
0.35 |
0.348 |
99.4 |
| 5 |
0.35 |
0.352 |
100.6 |
| 6 |
0.35 |
0.344 |
98.3 |
| 7 |
0.50 |
0.505 |
101.0 |
| 8 |
0.50 |
0.513 |
102.6 |
| 9 |
0.50 |
0.504 |
100.8 |
Limite di quantificazione (LOQ)
Diluire la soluzione principale di cloridrato di streptomicina a una concentrazione di 12 μg/ml. Analizzare il campione in condizioni cromatografiche e registrare il cromatogramma.Calcolare il rapporto segnale/rumore (S/N) del picco cromatografico dello streptomicina cloridrato e determinarne la ripetibilitàI risultati sono riportati nella tabella 7.
Tabella 7 Risultato della prova LOQ
| - No, no, no, no. |
SNR |
Area di picco (SU*s) |
Area di picco RSD (%) |
| 1 |
15.647 |
3.416 |
8.45
|
| 2 |
10.634 |
2.928 |
| 3 |
15.728 |
3.145 |
| 4 |
12.842 |
3.529 |
| 5 |
14.662 |
3.396 |
| 6 |
11.076 |
3.730 |
I risultati indicano che secondo il requisito della linea guida ICH di S/N > 10,la deviazione standard relativa dell'area di picco per questa concentrazione di soluzione di cloridrato di spectinomicina soddisfa i criteriPertanto, può servire come standard limite quantitativo per lo spectinomicina cloridrato.
5Conclusioni
Sulla base del metodo farmacopeale, questo studio ha stabilito una procedura analitica affidabile e robusta per la quantificazione dello spectinomicina cloridrato.Le condizioni del rivelatore di dispersione luminosa evaporativa (ELSD) sono state ottimizzate in modo sistematicoIl metodo ottimizzato ha dimostrato una maggiore stabilità e precisione, una maggiore sensibilità di rilevamento e una gamma lineare soddisfacente.
Il rilevatore ELSD3260 è un rilevatore a bassa temperatura a flusso diviso di nuova concezione e sviluppo, adatto all'analisi di sostanze non volatili e semivolatili,fornendo una valida alternativa per i composti privi di assorbimento UVIn questo studio, l' uso dell' ELSD3260 per l' analisi di cloridrato di spectinomicina ha portato ad eccellenti valori di risposta e riproducibilità, insieme a una maggiore sensibilità di rilevamento.Questi risultati dimostrano che questo strumento è adatto per l'analisi quantitativa dello spectinomicina cloridrato.
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